影响因子：6.2
伯豪技术服务：单细胞转录组测序
研究背景
胃癌（GC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，预后普遍较差。胃癌干细胞（GCSCs）因其自我更新能力、异质性分化潜能以及对化疗和靶向治疗的强耐药性，被认为是肿瘤发生、进展、复发和治疗抵抗的关键驱动因素。尽管靶向Wnt/β-catenin信号通路（GCSCs干性和耐药性的核心调控通路）是极具前景的策略，但目前缺乏临床可用的有效抑制剂。
主要技术
单细胞转录组测序
（技术服务由伯豪生物提供）
实验材料
人类GC细胞系（MGC-803、SGC-7901、BGC-823、MKN-45）；4至6周龄雄性裸鼠。
结论
通过高通量筛选临床获批药物库，发现抗生素药物氯福克酚（Clofoctol, CFT） 能高效抑制β-catenin表达，显著削弱GCSCs干性，并通过结合RanBP2蛋白诱导TNF介导的程序性坏死，为胃癌治疗提供了新的候选策略。
实验结果
1. 高通量筛选鉴定CFT为强效β-catenin抑制剂
筛选策略： 使用实时定量PCR（RT-qPCR）检测206种FDA批准的无明确靶点药物对胃癌细胞系MGC-803中β-catenin mRNA水平的影响。
关键发现：
10种药物（4.85%）能将β-catenin mRNA抑制至对照组50%以下（图1A, B）。
CFT表现出最强的抑制效果，显著降低多个GC细胞系（MGC-803, SGC-7901, BGC-823, MKN-45）的β-catenin mRNA和蛋白水平（图1C，附图S1A）。
细胞效应初探：
常规培养下，CFT（≤10 μM）在前48小时对细胞活力和凋亡无显著影响（附图S1B-D）。
营养应激增强CFT效应： 在低血清（1% FBS）模拟的微环境压力下，CFT处理7天后显著抑制GC细胞增殖，诱导S期阻滞并促进细胞凋亡（图1D-F，附图S2A-C）。
协同化疗： CFT与5-氟尿嘧啶（5-Fu）联用表现出显著的协同抗肿瘤效应（附图S2E, F）。
图1. CFT在低血清培养基中抑制β-catenin和细胞生长
2. CFT有效抑制GCSCs干性及致瘤性
干性标志物下调： CFT处理显著降低干性相关基因（Nanog, Oct4, Survivin, Sox2, Lgr5）的mRNA表达（图2A）。
自我更新能力受损：
体外球体形成： CFT处理显著降低GC细胞形成肿瘤球体的频率和能力（图2B，附图S3A, B）。
集落形成： CFT处理显著减少GC细胞的贴壁依赖性集落形成单位（CFU）（图2D）。
GCSCs标志物减少： 流式细胞术（FCM）分析显示，CFT处理显著降低CD44⁺/CD133⁺双阳性细胞群以及高醛脱氢酶活性（ALDH⁺）细胞群的比例（图2E, F，附图S4A, B）。
体内致瘤性减弱：
有限稀释实验： 将不同数量（10⁴, 10⁵, 10⁶）的GC细胞皮下接种裸鼠，CFT处理组形成的肿瘤更少、更小，表明CFT降低了具有肿瘤起始能力的细胞比例（图2G）。
次级移植瘤实验： 将CFT处理组来源的原代肿瘤细胞再次接种小鼠，形成的次级肿瘤数量和体积显著小于对照组，证明CFT处理可长期抑制肿瘤再生能力（图2H）。
迁移侵袭抑制： CFT通过下调上皮间质转化（EMT）相关蛋白抑制GC细胞的迁移和侵袭能力（附图S5A-D）。
图2. CFT在体内和体外抑制GC细胞干性
3. CFT选择性杀伤GCSCs并诱导凋亡/坏死
模型建立： 从4株GC细胞系和2例GC患者原代细胞中分离培养GCSCs。
选择性杀伤：
CFT（10 μM）能显著抑制6种不同来源GCSCs的活力，而同等剂量对普通GC细胞或正常细胞（HUVEC, 293T, GES-1, H9）影响甚微（图3A-C，附图S6A, B）。
GCSCs通常对化疗药5-Fu和顺铂（Cis）耐药，但CFT对其表现出强效杀伤作用（图3A）。
诱导细胞死亡：
FCM（Annexin V/PI）和Calcein-AM/PI活死染色证实CFT显著增加GCSCs的凋亡/死亡细胞比例（图3D, E，附图S6C, D）。
人凋亡抗体芯片： CFT处理改变多个凋亡相关蛋白表达，包括Caspase-3、HSP27、CytoC、FasL、Survivin和XIAP（图3F，附图S6E）。
活性氧积累： CFT诱导GCSCs内活性氧（ROS）显著累积（附图S6F）。
体内抗GCSCs活性：
裸鼠移植瘤模型： 将SGC-7901来源的GCSCs接种裸鼠，肿瘤体积达50 mm³后腹腔注射CFT（30 mg/kg/天，连续11天）。CFT显著抑制肿瘤生长，且不显著影响小鼠体重（图4A-D）。
机制验证：
免疫组化/免疫荧光：CFT处理组肿瘤中Cleaved Caspase-3表达升高（凋亡增加），CD44⁺/CD133⁺细胞比例降低（干性减弱）（图4E-G）。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）： 分析CFT处理组肿瘤细胞组成，发现具有高干性基因（NEAT1, COL7A1, MALAT1, IMMP2L）特征的细胞簇（Cluster 5）比例显著减少，且该簇细胞处于分化早期（图4H-K，附图S7C-E）。
图3. CFT抑制GCSC活率并诱导凋亡
图4. CFT在体内诱导GCSC凋亡
4. 分子机制：靶向RanBP2调控SerpinE1/β-catenin轴与TNF坏死通路
RNA-seq揭示关键通路：
CFT显著下调SerpinE1（与GC不良预后正相关）表达（图5B，附图S9A-D）。
CFT显著上调TNF表达，并富集到“细胞因子-受体相互作用”、“凋亡”和“坏死性凋亡”相关通路（图5D-F，附图S8C-F）。
蛋白互作（PPI）网络分析确认TNF是调控凋亡/坏死网络的核心节点（图5G）。
qRT-PCR验证CFT上调多个坏死性凋亡相关基因（TNF, IL6, IL18等）（图5H, I）。
图5. SerpinE和TNF是CFT的靶点
SerpinE1是CFT抑制干性的关键下游因子：
回补实验：在GC细胞中过表达SerpinE1，可部分逆转CFT对β-catenin的下调作用（图6A，附图S9E-G）。
过表达SerpinE1显著上调干性基因（Nanog, Oct4等）表达，并增强集落形成、球体形成和致瘤能力，而CFT处理能拮抗这些效应（图6B-G，附图S9H, I）。
图6. SerpinE1与CFT介导的GC细胞干性抑制有关
CFT激活TNF介导的程序性坏死（Necroptosis）：
CFT显著上调GCSCs中TNF mRNA和磷酸化RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白水平（图7B, C）。
使用特异性RIPK1抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1) 可剂量依赖性地阻断CFT诱导的TNF上调和细胞凋亡/坏死（图7D, E），证明CFT通过TNF-RIPK1/RIPK3/MLKL通路诱导GCSCs坏死性凋亡。
图7. CFT诱导TNF介导的GCSC坏死性凋亡
CFT直接靶向结合RanBP2：
网络药理学与分子对接： 预测出25个CFT潜在靶点，PPI网络分析及GC表达数据提示RanBP2（SUMO E3连接酶）是关键候选靶点（图8A，附图S10A-H）。
分子对接： CFT通过氢键与RanBP2的PHE-110残基稳定结合（图8B）。
DARTS验证： CFT结合可保护RanBP2蛋白免受蛋白酶降解（图8C）。
分子动力学（MD）模拟： 模拟CFT-RanBP2复合物100 ns动态，显示复合物RMSD、Rg、RMSF值稳定，结合自由能分解确认PHE-110等残基对结合贡献大，证实两者结合稳定（图8D-H，附图S10I）。
功能验证： 敲低RanBP2：
特异性降低SUMO1（而非SUMO2/3/4）蛋白水平（附图S10K）。
逆转CFT对SerpinE1、β-catenin和SUMO1的下调作用（图8I），证明RanBP2是CFT发挥功能的上游靶点。
图8. CFT与RanBP2结合调控靶蛋白
5. 机器学习构建CFT疗效预测模型
模型构建：基于RNA-seq数据，应用Lasso回归（LR）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）三种机器学习算法筛选特征基因。
核心基因：整合分析得到77个候选基因，进一步结合TCGA胃癌转录组数据，最终确定13个基因构成预测模型（附图S11A-C）。
预后价值：
根据风险评分将TCGA胃癌患者分为高风险组和低风险组。高风险组患者总生存期（OS）显著短于低风险组（P=0.00336）（附图S11D）。
多因素Cox回归确认年龄、肿瘤分期和风险评分是独立预后因素（附图S11F）。
风险评分对3年内预后具有良好预测价值（ROC曲线下面积AUC=0.627）（附图S11E, I）。
列线图整合风险评分与临床特征，可直观预测患者生存（附图S11G, H）。
总结
靶点结合：CFT直接结合SUMO E3连接酶RanBP2。
干性抑制：通过RanBP2下调SerpinE1表达，进而抑制β-catenin信号通路，削弱GCSCs干性、自我更新和致瘤能力。
诱导死亡：通过RanBP2激活TNF介导的RIPK1/RIPK3/MLKL依赖性程序性坏死途径，选择性杀伤耐药性GCSCs。
预测工具：基于13个基因的机器学习模型可预测胃癌患者预后及潜在CFT治疗反应。
临床转化价值：
老药新用：CFT作为已获批的抗菌药物，其安全性已知，重新定位用于胃癌治疗可加速临床转化。
靶向GCSCs：CFT能有效清除对传统化疗耐药的GCSCs，为克服胃癌复发和转移提供了新策略。
联合治疗：CFT与化疗药物（如5-Fu）联用展现协同效应，具有临床联合用药潜力。
图9. 机制图：CFT与RanBP2结合，诱导坏死性凋亡，抑制干性
参考文献：
Liu Y, Ma Y, Zhou B, et al. Clofoctol impairs the stemness of gastric cancer and induces TNF-mediated necroptosis by directly binding to RanBP2. Cell Mol Life Sci. 2025;82:194.