一般会有污染、细胞计数、生长缓慢、生长过快、贴壁细胞不贴壁、悬浮细胞死细胞多等情况。

细胞污染

首先呢，细胞污染是细胞培养过程中最常见也是让大家最头疼的一件事情，因为他会对我们的实验甚至于细胞产生十分严重的后果。所以，我们首先做的就是我们所使用的超净台的维护和清洁，使用前后要用75%酒精进行清洁,消毒。再有就是枪头和固体垃圾在超净台内的放置，也是需要注意的一点，要避免他们成为污染源。此外UV杀菌也是实验前必要的手段。

为防止污染实验前准备

细菌污染是比较常见的细胞污染之一，一般我们会镜下可看到黑色的到处乱跑的黑点。细胞一旦出现细菌污染，爆发会很快，培养基很快就会出现浑浊，且他们会很快的抑制正常细胞的生长，使其状态变差。这个时期，细胞培养液会变得粘稠， 且会产生一些异味。（给大家推荐一下中乔新舟支青霉素- 链霉素混合溶液双抗）

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另一个让大家比较头疼的是真菌污染，下图是一个酵母污染的细胞：

此时给大家的建议是，实验过程中，一定要和使用过酵母实验的超净台分开始用，真菌污染是很难清除的，一般只要被污染，细胞基本就要废弃了，真菌细胞会产生孢子，我们双抗之类的试剂也很难有效的杀死这些孢子，他们会在有害的条件下休眠，等条件适合了，会进行增殖，所以有时候这个污染会出现延迟性爆发现象。

另一点是大家比较头疼的是支原体污染了，据调查显示，亚洲是支原体污染概率出现最高的地区。

怎么很好的观察到支原体污染呢？一般情况下某些细胞在荧光显微镜的明场下，能看到一些细胞有一些丝丝拉拉的拖影。

此外呢，我们也可以购买一些支原体抑制剂试剂盒。（给大家推荐一下中乔新舟支原体清除剂升级版）

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进行提前的预防，另外就是我们操作上要多多注意一下细节，最后就是要保证我们的实验的环境。

细胞计数问题

计数规则是计上不计下，计左不计右，取混合均匀的10ul母液，计算红色小格内数量平均数然后乘上10的4次方，就是每毫升细胞数量。

细胞生长缓慢

遇到细胞生长缓慢的情况，采取的措施有：一是换一管或者其他批次的细胞进行培养，所以细胞要尽量多保存不同批次的细胞，二是可以相应的提高血清浓度（特殊的对血清敏感的细胞除外），一般15-20%即可，再高的的血清浓度反而不好，意义不大反而影响里面的营养成分。三是细胞密度也要多多注意，一般保持在1~5X105/ML，且保持新鲜的培养基，让细胞尽量获得好的营养。有些细胞生长缓慢，是需要特定的生长因子，如EGF、VEGF、GFG、IGF等等

生长过快

首先要怀疑是不是污染了，如果不是，就是我们接种密度要适当降低，或者使用更大的培养器皿去培养，或者适当的降低血清浓度。

贴壁细胞不贴壁

贴壁细胞贴壁不牢固，可能是贴壁时间不够，细胞不能充分的依附于细胞培养皿表面，可以在接种前离心培养，细胞贴壁牢固之后再换液培养。另一点可能是细胞本身的吸附力不够，此时我们需要对培养皿进行特殊的处理，以提高细胞的贴壁能力，可以使用包被液，如多聚赖氨酸、牛血浆纤维粘连蛋白、明胶、基质胶等等。（给大家推荐一下中乔新舟多聚赖氨酸）

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悬浮细胞碎片多

对于悬浮细胞出现很多细胞碎片的情况，死细胞的碎片会对其他生长良好的细胞产生影响，但是通过简单的离心又很难去除掉这些有害的细胞碎片。此时，我们一般使用Ficoll进行密度梯度离心进行分离。细胞离心后PBS悬液轻轻加入含有Ficoll的上层，离心机升降速调至最低，1500转离心10~20min左右，死细胞碎片会积聚在离心管底部，活细胞在整个液体中间层，为一层白色透明带，用移液器轻轻吸出中间层白色透明条带，稀释离心即可（此方法来自PBMC的分离经验）。（给大家推荐一下中乔新舟PBS磷酸盐缓冲液）

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