随着生物技术的飞速发展，mRNA疗法作为一种新兴的治疗手段，因其可编程性强、响应速度快等优势备受关注。在mRNA疫苗和基因治疗等领域中，高效合成高质量的mRNA是实现疗法目标的关键步骤。而在这一过程中，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）扮演着至关重要的角色，它能够高效地催化体外合成mRNA的过程。
尽管T7 RNAP在mRNA合成中发挥着重要作用，但实际操作中经常会产生double-stranded RNA（dsRNA）副产物。dsRNA是许多病毒的标志之一，因此它容易被细胞内的dsRNA结合蛋白识别，并触发先天免疫反应和炎症反应。这意味着，如果mRNA制剂中含有较高的dsRNA，可能会导致不必要的免疫激活，进而影响治疗效果或引起副作用。过多的dsRNA也可能会干扰mRNA的正常功能，包括翻译效率和mRNA的稳定性，间接影响mRNA治疗的效果。
图1.dsRNA副产物的影响与优化后的T7 RNAP反应[1]
因此，开发和采用有效的方法来减少dsRNA的生成是mRNA技术发展中至关重要的一部分。研究者们已经开发了多种策略，包括使用改良的T7 RNA 聚合酶，化学修饰核苷、调整 IVT 转录buffer，下游纯化工艺等方法。翌圣生物利用其ZymeEditor定向进化平台的能力，持续在进化mRNA体外合成的核心酶原料—T7 RNA聚合酶，开发出一款低dsRNA T7 RNA 聚合酶，抑制T7 RNA 聚合酶的RDRP活性，从根本上降低dsRNA的形成，从而可以大幅度降低dsRNA的含量。
产品数据
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产量：稳定在9mg/mL以上；
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dsRNA含量：dsRNA的含量显著降低了至少10倍以上；
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片段加帽率高：均超过99%。
Low dsRNA T7 RNA Polymerase筛选过程 通过方法构建随机文库&FADS高通量筛选方法，筛选超过10^6的随机突变文库。同时利用半理性设计&微孔板技术，筛选定点饱和文库。两种方法均获得了低dsRNA T7 RNA 聚合酶突变体。在考虑dsRNA含量的同时，也考虑不降低其他指标的前提下（如完整度/加帽率/产量等），选出一款突变体进行商品化应用。
产品数据 01
在不同长度的应用场景下，dsRNA无论跟WT T7 ，还是竞品，在保证其他指标不降的前提下，dsRNA 均有极显著下降。
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片段长度 |
T7 RNA pol |
产量（mg/mL） |
完整度（%） |
dsRNA含量（(1ug RNA产生 ng的dsRNA) |
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4K |
T7-WT |
12.4 |
88.3 |
0.4273 |
|
T7-低dsRNA |
12.1 |
89.9 |
0.0129 |
|
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竞品A |
11.0 |
87.8 |
0.0323 |
|
|
9K |
T7-WT |
9.5 |
81.9 |
2.9180 |
|
T7-低dsRNA |
9.0 |
82.0 |
0.0379 |
|
|
竞品A |
7.2 |
78.7 |
0.1805 |
02
降低Cap analog的投入量，在不同的片段长度，以及与WT的对比下，投入量降低到2.5mM， 仍能得到优异的加帽率。同时在细胞层面上，也能得到优异的表现。
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Cap analog投入量（mM） |
加帽率（%）-4K |
1K |
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WT |
mutant |
WT |
|
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10 |
100 |
100 |
100 |
|
5 |
100 |
100 |
100 |
|
2.5 |
100 |
100 |
99.7 |
翌圣公开的文章《FADS and semi-rational design modified T7 RNA polymerase reduced dsRNA production, with lower terminal transferase and RDRP activities》阐述了一项创新性研究。基于这项研究成果，翌圣已向中国、美国提交了专利申请。
产品信息
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产品名称 |
货号 |
规格 |
体积 |
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Cleascrip™ T7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL) |
10629ES10 |
10KU |
40 μL |
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10629ES60 |
100 KU |
400 μL |
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10629ES86 |
2500 KU |
10 mL |
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10629ES96 |
25MU |
100 mL |
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10629ES99 |
100MU |
400 mL |