近年来，随着生物制药的迅猛发展，以及在疫情期间细胞和基因治疗以及mRNA疫苗的出现，确保生物制药的安全性和可靠性已成为全球监管机构和政府关注的焦点。支原体污染是一种常见但往往难以消除的污染类型。监管要求规定，涉及细胞培养的生物工艺过程必须确保“无支原体污染”。

支原体检测法规要求

原材料→细胞培养基→种子细胞→种子细胞培养→细胞收集→细胞纯化→终产品

在《中华人民共和国药典》2020年版第三部“生物制品生产用动物细胞基质的制备和质量控制”中，提出对于生产细胞，应在主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）和生产结束细胞（EOPC）进行支原体检测。

在“细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）”中，建议在关键时间点对适当的中间样品进行支原体和其他与安全相关的检测，或采取相关措施进行控制。最终产品的放行检测也要求进行支原体检测。

根据美国FDA的“用于传染病指示病毒疫苗生产的细胞基质和其他生物材料的特性和鉴定指南”，要求对原材料、病毒种子和未加工收获液进行支原体控制。

核酸检测（NAT）和传统方法

在核酸检测（NAT）作为一种快速检测方法出现之前，传统的基于培养的方法和指示细胞测定法由于其较长的检测周期或敏感性问题，导致了生产周期的延长或需要根据风险评估或寻找替代方法来有条件地放行细胞基质。随着细胞和基因治疗的发展，行业对病原体检测的及时性和敏感性的需求增加了。更短的货架期不足以支持如此长的检测周期，因此NAT方法在众多病原体检测方法中脱颖而出。

目前，欧洲药典（EP）<2.6.7>、日本药典（JP）和美国药典（USP）<63>都已将NAT方法作为病原体检测方法。但是，在使用前需要验证这种方法，并与传统方法比较其检测敏感性。尽管2020年版的中国药典（ChP）没有将NAT作为病原体检测方法，但它提到可以使用“国家药品监督管理部门批准的其他方法”。

2022年5月，国家药品监督管理局药品审评中心发布了《细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，其中指出：“当样本量有限，或需要快速放行，且药典方法不适用时，可以开发新的无菌及病原体检测方法用于放行检测，但这些新检测方法应进行充分的验证。”因此，预计NAT将越来越多地被原料供应商和先进治疗药物产品（ATMP）公司作为能够支持快速病原体放行检测的方法所使用。

NAT方法验证要求

NAT方法的验证在欧洲药典<2.6.7>和日本药典中都有详细说明，且内容基本一致。国家食品药品检定研究院（NIFDC）还发表了一篇题为“病原体核酸检测方法及方法学验证的考虑”的文章，旨在为中国核酸扩增方法病原体检测的开发者和用户提供指导。病原体检测的NAT方法需要进行特异性、检测限和稳健性验证。如果使用商业化检测试剂盒进行病原体检测，则可以根据供应商提供的全面试剂盒性能验证报告，结合实验室环境和样本类型，进行适当的方法适用性验证。

特异性

特异性指的是在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）存在的情况下，分析方法准确测量目标分析物的能力。在欧洲药典（EP）中提到，在验证过程中，应注意与密切相关的细菌种类之间的交叉反应，如包括梭菌属（Clostridium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和链球菌属（Streptococcus）的革兰氏阳性菌。此外，还应考虑宿主细胞和实验室操作环境中常见的人类DNA污染类型。

检测限

检测限指的是样品中能够被检测出的分析物的最低量。检测限作为限度检验和定性鉴定的标准，不需要被准确定量为一个确切值。在欧洲药典（EP）中，要求每种病原体和每个稀释浓度都有24个检测数据点。这可以通过在不同天进行三次独立的10倍系列梯度稀释，每个稀释梯度进行8次重复检测来实现；或者在不同天进行四次独立的10倍系列梯度稀释，每个稀释梯度进行6次重复检测。建立检测限需要超过95%的检测阳性率。

对于需要确认检测限的病原体类型，试剂盒制造商应尽可能多地覆盖法规药典要求的病原体类型，并探索每种病原体的检测限。对于生物制药公司来说，通常需要根据实际使用的原材料来源进行选择。此外，还应考虑人类来源的病原体类型。

如果在生产过程中使用或接触到禽类细胞或材料，则应进行鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae）的检测限验证。

如果在生产过程中使用或接触到昆虫或植物材料，则应进行螺旋体（Spiroplasma）的检测限验证。

猪鼻支原体（Porcine nasal mycoplasma）在支原体污染样本中高度流行，并已受到中国国家食品药品检定研究院的关注。

与欧洲药典相比，日本药典在检测限验证中没有提及鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）。相反，它除了提及的标准之外，还包括了口腔支原体（Mycoplasma orale）。

耐受性

耐受性指的是在测量条件发生小的变化时，测量结果不受影响的程度，为所建立方法在常规测试中的使用提供了依据。在评估耐受性时，需要注意病原体检测方法对检测试剂中MgCl₂、引物和dNTPs浓度变化的耐受性，核酸提取试剂盒或提取步骤的变化，以及对使用不同核酸扩增仪器的耐受性。

可比性研究

如果NAT方法要用作替代药典方法，需要通过比较确认NAT能够替代基于培养的方法或指示细胞培养方法。通常，这涉及到考虑方法的检测限以及特异性（如覆盖的病原体范围和潜在的假阳性）。对于检测限的比较，必须满足“检测限达到10 CFU/mL可以替代基于培养的方法；检测限达到100 CFU/mL可以替代指示细胞培养方法”的标准。

进行可比性研究有两种可选的方法：

1、使用相同的验证过的病原体菌株，对NAT方法和药典方法同时进行同步实验，以确认检测限。

2、将NAT的验证结果与药典方法的验证结果进行比较，但需要仔细记录两种方法中使用的病原体标准品的确认文件。

DfCell支原体检测的验证内容

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它可以与基于磁珠的残留DNA样本前处理试剂盒结合使用，进行手动提取，或使用Auto-Pure 32A全自动核酸提取仪器进行自动化核酸提取。在前处理去除干扰杂质并获得纯化的支原体DNA后，通过qPCR收集探针的荧光信号，从而确定检测结果。