N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 ,99%

P394623

蛋白质L琼脂糖

R488105

RIPA 缓冲液 ,

R355028

ReadytouseTM PBS速溶颗粒（pH 7.4） ,

R394624

重组蛋白G琼脂糖 ,

S301560

氯化钠溶液 ,5mol/L

T434565

Triton™ X-102 ,

M301574

β-巯基乙醇 ,分子生物学，用于电泳，细胞培养，99%

免疫沉淀简介

免疫沉淀（IP）是应用最广泛的免疫化学技术之一。免疫沉淀，然后是SDS-PAGE和免疫印迹，通常用于各种应用，例如：确定蛋白质抗原的分子量，研究蛋白质间相互作用，确定特异性酶活性，监测蛋白质翻译后修饰，并确定蛋白质的存在和数量。IP技术还能够检测稀有蛋白质，否则很难检测，因为它们可以通过免疫沉淀浓缩到1×104倍。

在IP方法中，来自细胞或组织匀浆的蛋白质通过免疫复合物在适当的裂解缓冲液中沉淀，所述免疫复合物包括抗原（蛋白质）、第一抗体和蛋白质A-、G-或L-蔗糖缀合物或第二抗体琼脂糖缀合物。琼脂糖缀合物的选择取决于初级抗体的物种来源和同种型。所描述的方法是可比较的，并且方法的选择取决于特异性抗原抗体系统。

试剂和设备

1.琼脂糖缀合物：固定在Sepharose®CL-4B（产品编号P405880）或G蛋白琼脂糖4B（产品编号R394624）或L蛋白琼脂糖（产品编号P394623）上的A蛋白，或抗体-琼脂糖缀合体（根据第一抗体的物种来源和同种型的第二抗体缀合物）

2.细胞或组织裂解物制备

3.免疫沉淀一级抗体和非相关抗体（阴性对照）

4.SDS-PAGE和免疫印迹试剂及设备

5.HNTG缓冲液：20mM HEPES缓冲液，pH 7.5（产品编号H109406），含有150mM NaCl（产品编号S301560）、0.1%（w/v）Triton X-100（产品编号T434565）和10%（w/v）甘油（产品编号G424796）

6.洗涤缓冲液（冰冷）：HNTG缓冲液，或PBS pH 7.4（产品编号R355028），或根据所需洗涤严格程度的其他缓冲液（RIPA缓冲液 产品编号 R488105）

7.具有或不具有2-巯基乙醇（2-ME（产品编号M301574））的莱姆利样品缓冲液（例如1x、2x或3x）

8.微型离心管

9.微型离心机和振动筛

免疫步骤

特异性抗原的免疫沉淀

注意：除非另有说明，否则在冰上使用微型离心管执行所有IP步骤。

用洗涤缓冲液洗涤琼脂糖缀合物两次，在室温下以12000xg离心10秒，丢弃上清液。

注意：如果琼脂糖缀合物是粉末，则用去离子H2O将其重建，并使其膨胀5分钟。

在洗涤缓冲液（50%悬浮液）中重新悬浮琼脂糖缀合物。

根据需要，继续使用方法A或方法B。

方法A

1.在微量离心管中将琼脂糖缀合物分成50-100µL（约25-50µL琼脂糖/床体积）的等分试样。

2.在每根试管中加入10µL适当稀释的初级抗体。

3.在室温下培养15-60分钟，在合适的摇壶上轻轻混合样品。

4.在4°C下以3000xg离心2分钟，丢弃上清液。

5.用1mL洗涤缓冲液洗涤每个样品，在4°C下以3000xg离心2分钟，重复此步骤至少两次。

6.向每根试管中加入0.1-1.0 mL的细胞裂解物。

7.在4°C下培养90分钟至过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。

8.通过在4°C下以3000xg离心2分钟来收集免疫沉淀的复合物，丢弃上清液。

9.用1 mL洗涤缓冲液洗涤颗粒，在4°C下以3000xg离心2分钟。重复此步骤至少3次。

方法B

1.向细胞裂解物样品（0.1-1.0 mL）中加入10µL适当稀释的抗体（参考产品规范）。

2.在4°C下培养90分钟至过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。

3.加入50-100µL琼脂糖缀合物悬浮液（约25-50µL琼脂糖/床体积）。

4.在4°C下培养15-60分钟，用摇壶轻轻混合样品。

5.通过在4°C下以3000xg离心2分钟来收集免疫沉淀的复合物，丢弃上清液。

6.通过重悬浮和在4°C下以3000xg离心2分钟，用1ml洗涤缓冲液洗涤颗粒。重复此步骤至少3次。

SDS-PAGE的制备

1.将每个颗粒重新悬浮在25-100µL莱姆利样品缓冲液中，最终浓度为1x样品缓冲液，将样品在95°C下加热5分钟。

2.在室温下以12000xg离心30秒。收集上清液（IP样品）。如果需要，（在蛋白质稳定性允许的情况下）IP样品可以储存在-70°C的样品缓冲液中。

3.在SDS-PAGE上运行已知浓度的样品和MW标准品（聚丙烯酰胺凝胶的适当百分比取决于蛋白质的分子大小）。

4.转移到硝化纤维上，进行免疫印迹。

免疫沉淀（IP）的常见问题及解答

1. 用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验？

答：抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同，和抗原以及Protein G或Protein A的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。一般来说，多抗是沉淀反应最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂？

答：从活性细胞裂解出来的样品中，往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，并且在低温下进行实验。

3. 溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么？

答：多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱表面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合。

4. 免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例？

答：每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清；缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。

5. 免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液？

答：适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和；DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗体完全失去活性。

参考文献

[1] Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.

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