酵母裂解酶 20T来自藤黄节杆菌

Zymolyase 20T From Arthrobacter luteus

简述：

   Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通过Arthrobacter luteus(藤黄节杆菌)深层培养获得的酶制剂，它能有效的裂解活酵母细胞细胞壁。该制剂是利用硫酸铵对培养液的盐析作用获得的冻干粉，其酶活单位是20,000 单位/g.其中主要负责裂解活酵母细胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通过对ß-1,3-葡聚糖连接位水解葡萄糖聚合物，释放产物主要是昆布五糖。

产品说明：

单位定义：800nm条件下菌液吸光度下降30%，表示一个活力单位。

特异性：此产品的裂解谱包括以下属的微生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于细胞裂解、原生质球形成及葡聚糖水解。

说明:酵母细胞的裂解程度随酵母菌的种类、生长阶段及培养条件而改变。

声明: Zymolyase是麒麟麦酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注册商标。存：

储存:冻干状态于2-8°C中保存，若30°C下放置3个月约失去70%活力。

外观:冻干粉

活力：20,000单位/g

核心酶：ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶，约1.5 x 10⁶单位 /g

         蛋白酶，约1.0 x 10⁴单位 /g

甘露聚糖酶, 约1.0 x 10⁶单位 /g

 淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未检出）

催化剂：二硫苏糖醇（DTT）, ß-巯基乙醇及其他的巯基化合物（如半胱氨酸）

最适pH及温度：

     pH 7.5, 35°C裂解活酵母细胞

     pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范围：pH 5-10间保持稳定

热稳定性：60°C，5min丧失细胞溶解能力

警告：使用非**纤维滤器过滤除菌

原生质球制备程序：

1.     室温条件，5000rpm（3000 xg），5min离心酵母培养物；

2.     收集离心沉淀物（酵母细胞）并记录湿重；

3.     用TE缓冲液悬浮细胞，加入量为1.4ml/g湿重细胞；（TE缓冲液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4.     双蒸水快速定容，终体积量为3.5ml/g湿重细胞；

5.     按照17.5 ul (总体积的1/200)/ g湿重细胞的量加入ß -巯基乙醇（MP 806445），目的是为了除去细胞外层中的甘露聚糖层；

6.     30°C轻摇温育混合液，处于对数期生长的培养物处理15min，处于稳定期生长的培养物处理45min；

7.     室温条件，5000rpm离心5min；

8.     用S缓冲液重新悬浮细胞，加入量为4.0ml/g湿重细胞；（S缓冲液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9.     5000rpm离心5min；

10.  再次用S缓冲液（4.0ml/g湿重细胞）悬浮细胞，另外加入Zymolyases（50U /g湿重细胞）；如果Zymolyases配制成附录所示的溶液，则添加250ul即可。最好根据实验情况最先优化酶使用量。

11.  30°C轻摇温育混合液30min，根据以下方式监测原生质球形成程度：

（1）       加1ul样品到20ul S 缓冲液内，原生质球应该保持完整；

（2）       加1ul样品到20ul双蒸水中，原生质球应该破裂；显微镜下观察比较两个样品的形态差异。

12．一般情况下反应45-60min，原生质球的形成量>90%，此时4^oC下离心收集细胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S缓冲液（2 ml/g湿重细胞）悬浮原生质球，5000rpm离心5min；重复此步骤做第二次清洗；；

14.原生质球离心沉淀物-70^oC冻存。

裂解原生质球获取细胞核：

   温和的裂解原生质球方法如下; 用3倍体积的18%Ficoll（MP 160003）溶液悬浮细胞离心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl₂ (MP 195088)的10 mM PIPES 缓冲液内，pH 6.5。

酵母菌基因组DNA的制备：

 以下步骤快捷，适合于从少量酵母培养物中制备基因组DNA ：

1.     将过夜培养的10ml酵母菌培养物离心收集细胞，加入280ul TE Buffer（配方见原生质球制备程序中的步骤3），300 ul双蒸水，3 ul ß -巯基乙醇（MP 806445）；

2.     30^oC温育45min；

3.     以台式离心机的最高速度离心2-3s，弃上清液，沉淀物用500 ul S 缓冲液（配方见原生质球制备程序中的步骤8）悬浮.；再次离心弃上清；

4.     用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S缓冲液悬浮细胞沉淀物（或者使用自己认为最合适的酶浓度）；

5.     30^oC温育1小时；

6.     重复步骤3；

7.     用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 缓冲液悬浮细胞沉淀物；

8.     37^oC温育3小时，不时的混匀溶液；

9.     调水浴锅的温度至65^oC，并温育20min；

10.  从水浴锅内取出并冷却至室温；

11.  用200ul 1:1的Tris饱和酚-氯仿混合液萃取，漩涡混匀并离心；从离心机内取出并保留上清液；

12.  用200ul氯仿萃取上清液，之后重复漩涡混匀及离心；

13.  加入500ul95%乙醇到上清液内，20^oC沉淀10min；

14.  4^oC下，15,000 xg离心20 min；

15.  自然风干或者于真空离心蒸发浓缩器内晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE缓冲液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16.  37^oC温育1小时；

17.  重复步骤11和12；

18.  加入2.5倍体积的95%乙醇，20^oC沉淀10min；

19.  30ul双蒸水重悬DNA。对1:500的DNA稀释液测量A₂₆₀，根据消光系数计算DNA产量；

20.