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新型离心技术

作者:湖南凯达科学仪器有限公司 2008-12-26T00:00 (访问量:3131)

德国贺利氏分离技术公司自从专业制造实验室离心机的近40年以来,始终在欧洲占**地位。目前贺利制造的离心机,从最简单的小型台式离心机,到最尖端的、用现代化微处理机控制的冷冻超速离心机。

1.以连续流动离心法,实验室规模从肉汁培养液申收集细菌

贺利氏离心机300MD系统以冷冻、高速、台式离心机Contifuge 17RS与铝合金或钛的连续流动转头相结合为基础而构成。两种转头的沉淀容量都有300ml,钛转头最大转速是15000rmin

可移动的Contifuge 300MD系统由配备有自动控制蠕动泵的高速冷冻台式离心机Contifuge 1 7RS所组成。蠕动泵装在安放离心机的手推车上。如果需要,这个装置还可配上温度范围由-1 5120"C的穿流冷却器、容量为10的玻璃接收容器以及磁搅拌器。由于Contifuge 300MD具有可移动性和结构紧凑等优点,它才能由一个发酵器或生物反应器转移到下一个发酵器或生物反应器,可以在现场收集细菌。例如,这个系统可以在40分钟内由20细菌培养液中收集到大肠杆菌,清出率达98%

钛连续流动转头由旋转鼓和固定的联接器所组成,用1个滚珠轴承将它们同轴地连接在一起。细菌悬浮液通过中央导管进入转头.并经由锥形槽缝流入转鼓。细菌就沿着鼓壁沉淀下来。澄清的培养肉汁则由1个带排水口的刮盘出转头,并通过联接器送出去。转头的旋转和固定部分相互间是密闭的,以甘油作为液体密封,甘油也保护了转头内的食物免遭环境大气污染。

已做过的若干实验可说明各种不同的细菌浮液在不同的流动速度下的清出程度。在实验中,Contlfuge 300MD系统的钛连续流动转头的通过蠕动泵连续地注入细菌悬浮液的同时,都以4 O00rmin的速度在旋转着。当离心温度设定为4时,细菌悬浮液不需要预冷。装满的转头加速到15 O00rmin时,就可收集细菌了。分离后,转头停止旋转并将它取出离心机。排去多余的液体,就可轻而易举地打开转头。刮出转头壁上的细菌沉淀,就可用来做研究了。

将生长得很好的大肠杆菌培养液种到20Luri Bertani培养基中,在30保温,到波长576nm的光密度达到12为止。改变蠕动泵的进料速度,就可得到程度不同的清出效果。含有大量酵母浸液或其它复杂添加物的肉汁培养在生长和离 L-时很容易起泡沫。这时,由于所选用的菌株产生出气体,就会增加泡沫的形成。但Contifuge 300MD的清出能力却不受其影响。

伍德氏醋酸杆菌( cetobacteriura Wooddid20古有2 酵母浸液的矿质培养基中厌氧生长。在30'C培养到波长578nm的光密度为11时为止。伍德氏醋酸杆菌是椭圆形到杆形的细菌。它们有一或两条近端鞭毛,因此极富运动性,一般认为很难分离。然而Contifuge300MD却可以收集,即使更小且运动性的细菌同样不降低清出率。

显而易见,连续流动离心适用于大多数细菌培养物,也可以选用来进行较大体积的收集工作。

适用于20L发酵器的下游加工的最新开发出的离心机是将连续流动离心机Contifuge300MD1个横向流动的超滤设备结合而成,这样就可以由发酵器培养物中浓缩胞外酶。

与传统的方法相比较,将连续流动离心法和横向流动超滤法结合成为一个连续的过程就具有下列优点:

         1. 缩短了操作时间;

         2. 大为减少了所需要的膜面积;

         3. 减少了装填体积以及最终浓缩物的量。

浓鳍淀粉酶的实验结果是:总的起始体积 2O升;最鲣体积02总产率 70%全过程耗时4小时。

2.快速纯忆质粒DNA(脱氧核糖核酸)

离心色层吸附柱(Horaprep p-DNA)设备是用来纯化和恢复在细菌染色体中的双链质粒DNA的。这个离心柱的方法令人注目地代替了使用溴乙锭一氯化铯的密度梯度的纯化法,并且宣告了不再需要超速离心而可实现全部离心操作过程:收集细菌、制备澄清的溶菌液、制备粗的质粒DNA和最终纯化质粒。

用离心色层柱Heraprep p-DNA制备的质粒ONA有着可与溴乙锭一氯化铯密度梯度纯化的质粒相媲美的纯度。广泛地检测了用离心色层柱Heraprep p-DNA纯化的质粒DNA,证明其纯度适用于限制性内切酶分析、连接、转染哺乳动物细胞和转化细菌。此外,大小由2.7kb到至少23kb的质粒DNA都可以用Heraprep P—DNA柱来纯化。

Heraprep P—DNA离心色层柱还包括1个处理管和1个收集管。一旦制备好粗的质粒DNA,并且将它悬浮于1.8ml的10ml TrisHCL,pH值为8.0,lmM EDTA,IM NaCI溶液中时,样品就可以在Heraprep P—DNA柱中离心了。

在启用这根柱时,除去其顶部与底部的封口,排去过量的平衡缓冲液。然后将柱放在1根收集管中.装入16ml的套简,在HSA7.290不平转头中, 1 100×g离心lmin,这根柱就作好使用准备了

收集到的流出液和收集管一起丢掉。树脂在上部的柱支撑物之下压缩了大约lcm是正常的。

样品的体积是1.8ml。样品必须十分小心地加到树脂床的支撑物上面去。

柱和收集管这一套装置在2O℃下,以2 430r/min(1 100Xg)的速度离心25min

向含有纯化质粒的流出液中加入0.6体积的异丙醇,颠饲一下加以混合,室温下20min。

在2O℃ 下,用HFA 固定角转头22.5O,以l 000r/min(1 200×g)的速度离心30min回收质粒DNA。用冷的70 乙醇洗质粒DNA1次,真空抽干并悬浮于适当的缓冲液中。

虽然,高速转头的种类还可以由一些特殊型式来进一步扩充,例如连续流量式和洗涤式转头等,但是,现有的转头及其附件已经能够应付所有的离心任务了,并且典型地属于超速离心任务 试样的容器和常用的以及商业上通用的容器是一样的。

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